A jelenleg harmadik gyermekével várandós Natalie Portmanre – eredeti nevén Natalie Hershlag – 10 éves korában figyelt fel egy ügynök, és modellmunkákat ajánlott neki. Portman azonban hamar rájött, hogy valójában a színészet érdekli igazán. Később egy interjúban úgy fogalmazott: „…különböztem a többi gyerektől. Sokkal ambiciózusabb voltam, és tudtam, mit akarok elérni, ezért nagyon keményen dolgoztam. Nagyon komoly gyermek voltam.”

Az iskolai szünetekben színházi táborokban vett részt, ahol olyan darabokban szerepelt, mint a Kabaré vagy a Szentivánéji álom. 1994-ben Jean Reno oldalán kapta meg Mathilda szerepét a Léon, a profi című filmben, amellyel a nagyközönség figyelmét is felkeltette, és a kritikusok is elismerően fogadták alakítását.

Ekkor döntött úgy, hogy felveszi nagyanyja leánykori nevét, és ettől kezdve ezen a néven szerepel a filmjeiben. Erre azért volt szükség, mert szeretette volna megóvni saját és családja magánéletét a média túlzott érdeklődésétől.

Portman egy, a Hollywood Reporternek 2023-ban adott interjújában arról beszélt, hogy fiatal nőként bonyolult nem volt könnyű számára a Léon: A profi című filmben való szereplés és annak fogadtatása.

A 90-es évek közepétől Portman előtt megnyílt Hollywood világa, és egymás után kapta a szerepeket olyan filmekben, mint a Szemtől szemben, a Gyönyörű lányok, a Varázsige: I Love You vagy a Támad a Mars!. Ugyanebben az időszakban felkérték Baz Luhrmann Rómeó + Júlia című filmjének főszerepére is, melyet visszautasított a szerelmi jelenetek és a Leonardo DiCaprio és közötte lévő korkülönbség miatt. Nem vállalta el a Lolita szerepét sem, a Jégvihar hangulatát pedig túl sötétnek találta.

1997-ben az Anne Frank naplója Broadway-adaptációjában kapta meg a címszerepet, majd a Mindenütt jó című filmnél kezdetben szintén visszakozott a meztelen jelenetek miatt, végül azonban a forgatókönyv módosítása után elvállalta a szerepet. Alakítását Golden Globe-jelöléssel ismerték el.

Az igazi áttörést Padmé Amidala szerepe hozta meg George Lucas új Star Wars-trilógiájában, amely az eredeti filmek előzményeit mesélte el. A szerep világszerte ismertté tette, az első rész 1999-ben került a mozikba.

A korai évek képei ma már nem csupán nosztalgikus pillanatfelvételek. Azt is megmutatják, hogyan lett a tudatos, komoly gyerekszínészből Hollywood egyik legösszetettebb pályát bejáró sztárja. A 2002-ben Claire Danesszel készült közös fotó már egy új korszak küszöbén mutatja Portmant: ekkorra túl volt a gyereksztárságon, a Star Wars világsikerén, és éppen afelé haladt, hogy generációja egyik legizgalmasabb színésznőjeként tekintsenek rá.